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杂质相对校正因子的测定——实战篇

发布时间:2019-09-05 14:05 来源:未知 编辑:admin

  校正因子的测定有单点法、多点法、标准曲线法及吸收系数比值法。已有多篇文献报道过各方法的基本操作及优缺点,在此不再赘述。在进行校正因子测定时,小编建议采用标准曲线法,因为线性试验是方法验证必不可少的一项内容,在此采用标准曲线法,既验证了杂质对照品及主成分的线性,又可得到准确的校正因子,可谓一举两得。

  在进行校正因子的测定时,首先将各杂质对照品及主成分对照品配制成一定浓度的储备液,逐步稀释,直至找到各杂质的定量限,线性范围应包括定量限浓度~限度浓度的150%,主成分的浓度范围应包括定量限浓度~自身对照浓度的150%。例如,有关物质测定时,供试品的浓度为1mg/ml,采用0.1%的自身对照(即自身对照的浓度为1μg/ml),杂质A的限度为0.1%(即杂质A的限度浓度为1μg/ml),假设主成分及杂质A的定量限均为20ng/ml,则杂质A和主成分应在20ng/ml~1.5μg/ml的范围将浓度与峰面积进行线性回归,相关系数应大于0.990,Y轴截距应在100%响应值的25%以内。绘制出各杂质及主成分的线性曲线后,各杂质与主成分线性方程斜率的比值即为该杂质的校正因子。若杂质的校正因子在0.9~1.1的范围内,无需验证,直接采用自身对照法,若杂质的校正因子0.2~5.0之间,则需要采用加校正因子的自身对照法,若杂质的校正因子小于0.2或大于5.0,可考虑变换杂质的检测波长,重新进行测定,若所有的测定均在0.2~5.0之外,则表示加校正因子的自身的对照法不适用,需要用外标法进行定量。

  在配制各浓度的线性溶液时,一定注意需逐级稀释,要避免出现下图1所示的情况,应如图2所示,保证个点分布的均匀性。

  在采用加校正因子的自身对照法进行定量时,一般采用相对保留时间对杂质进行定位,在此,一并对相对校正因子及相对保留时间的耐用性进行考察。

  具体考察方法同其他方法验证的耐用性试验,即变换波长、流速、柱温、流动相比例、流动相pH值、采用不同品牌的色谱柱、仪器等。将各杂质对照品与主成分配制成混合对照品溶液,采用标准曲线法,绘制各条件下杂质对照品及主成分对照品的线性方程,计算校正因子,同时计算出各条件下杂质对照品相对于主成分的相对保留时间。

  对相对校正因子,除波长的变化会对相对校正因子有所影响外,其余色谱条件的调整均不会对相对校正因子产生影响,因此,测定波长的选择要避开吸光度急剧变化的位置,应选择在最大吸收或最小吸收的位置。校正因子的变化范围在多少范围内可以接受,目前,没有定论,小编认为,如果最终标准中相对校正因子只保留到小数点后一位,例如0.7,则各条件下校正因子均控制在0.65~0.74范围内,即可判定耐用性较好。即采用有效数字的修约规则,修约后为标准中规定的数值即可。

  对相对保留时间,除波长的变化对其没有影响外,其余各条件的变化均会对其产生影响,为了保证对杂质的准确定位,必须对相对保留时间的耐用性进行考察。此处的试验不是为了证明相对保留时间的耐用性良好,而是通过耐用性考察确定出如何采用相对保留时间对杂质进行定位。例如,固定色谱柱的填料及品牌,固定主峰的保留时间等。至于RRT在多少范围内可以接受,不能一概而论,若杂质谱较复杂,则质量标准中的RRT需要保留至小数点后两位,如果杂质谱相对简单,各杂质距离较远,RRT保留至小数点后一位即可。在此,跟大家分享另外一个经验,即如果某些杂质的相对保留时间无法固定,随色谱参数的变化较明显,则可以采用将主成分进行定向破坏,通过系统适用性试验来对杂质进行定位。

  配制相同的供试品溶液,同时采用加校正因子的自身对照法及外标法,对供试品中的杂质含量进行测定,对两种方法的测定结果进行比较,校正因子与外标法计算结果的负偏差不得过0.05%,正偏差不做规定。若供试品中检出的杂质较少,可在供试品中加入一定量的杂质对照品,来进行测定。

  至此,可将相对校正因子固化到质量标准中,采用加校正因子的自身对照法对已知杂质进行定量计算,既保证了定量结果的准确,又简化了试验,节省了对照品的用量。

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